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广州昱杰生物科技，以“科学家的问题解决者”为愿景，代理产品涉及分子、影像、细胞、生物、数字病理等多个专业领域，代理品牌包括：PerkinElmer、 ThermoFisher（ABI荧光定量PCR仪） 、 Cytek、 IndicaLabs、 Olink、江苏卓微JIMBIO、厦门福流 Nano FCM、江丰生物 KFBio、佰诺全景 PanoVUE、天根生化、富士 Visualsonics等多家国际知名生命科学相关品牌。

突破空间组学研究极限：Visium HD 与 Xenium In Situ 的完美融合

Visium HD和Xenium原位分析

新型的空间转录组学工具将传统成像与分子分析融为一体，让您更全面地了解感兴趣的生物学特征。无论您是揭示神经系统复杂性的神经科学家，还是深入解析肿瘤微环境的转化研究人员，抑或是尝试回答各种其他问题的科学家，空间维度的见解都能为您的研究项目打开新的大门。

互补的空间工具：

Visium HD和Xenium原位分析

Visium HD是一种基于测序的空间转录组学分析，它采用基于探针的化学方法进行空间背景下的全转录组分析。将探针与靶点杂交，再与标准载玻片上的组织相连接。洗掉未结合的探针，然后通过CytAssist将结合的探针精确转移到Visium HD玻片上（这个关键步骤可通过最大限度减少扩散来提高空间保真度）。然后利用这些探针生成带有空间条形码的NGS文库，以便生成测序读数。
Xenium是一种基于成像的空间转录组学分析，使用了靶向预选基因的锁式探针。与目标基因杂交后，探针通过连接而环化（为靶点特异性增添了一层可信度），并在滚环反应中扩增。之后在Xenium分析仪上，通过多轮荧光探针杂交、组织成像和探针去除对扩增产物进行检测，产生基于成像的读数。
Ayako Suzuki博士正是这么做的。根据她最近发表在《Nature Communications》上的文献（5），她首先使用Visium v2来确定肺部肿瘤中的基因表达变化发生在哪些位置，然后用Xenium来放大，精确定位与肿瘤亚型中的肺泡塌陷相关的特定细胞和细胞类型。
技术规格比较

关于多重分析：

全转录组、靶向分析和定制选项

多重分析：单次分析可测定多少种RNA（基因、外源基因、同源异构体等）。
每个平台达到的转录本覆盖广度和深度各不相同。为了提供广泛的覆盖，Visium HD能够无偏地覆盖整个转录组（约20,000个基因）。再结合为其他感兴趣的靶点设计定制探针的能力，Visium HD具有无以伦比的空间发现能力，能够表征广泛的组织，从头鉴定感兴趣的区域或细胞类型。
同时，Xenium通过多达480个基因的基因组合带来了靶向分析功能（2024年即将推出的Xenium 5K人类和小鼠基因组合将扩展到5,000个基因）。这些预设计的基因组合有多种配置，带有组织或应用特异性的靶点，最多可定制添加100个目标基因。
多重分析比较

表征灵敏度：

单基因灵敏度、基因检测范围和转录本丰度

灵敏度：定义检测转录本的效果如何。尽管在空间技术领域被广泛使用，但可以细分为：单基因灵敏度、基因检测范围和转录本丰度。使用哪个术语取决于作者想要强调哪个具体方面的性能。

单基因检测灵敏度

分析能够检测到的每个基因的转录本数量。这个指标在分析差异基因表达和检测稀有转录本、同源异构体和基因变异等应用中至关重要。再结合基因检测范围，这个指标有助于确定分析的动态范围。

基因检测范围

您能够在每个细胞或组织区域内检测到多少种不同的转录本，具体取决于单基因灵敏度、多重分析和组织类型。在以发现为重点的应用中，基因检测范围特别重要，例如表征健康或疾病状态下的感兴趣组织。

转录本丰度

每个细胞或组织区域内可检测到的转录本总数。这个指标可用来确定整体基因表达的大范围变化。根据分析方法的单基因灵敏度、基因检测范围、多重分析以及分析的组织总面积计算得出。

那么Xenium和Visium的灵敏度相比之下如何呢？尽管Xenium和Visium HD的直接比较数据正在生成当中，但我们最近在《Nature Communications》杂志上发表了一篇论文，对Xenium和“标准清晰度的”Visium v2在连续组织切片上的灵敏度进行了比较。

在这个特定实验和样本中，Xenium的单基因灵敏度高于Visium v2，而Visium v2的基因检测范围和转录本丰度均高于Xenium。这在很大程度上是由于Visium捕获了整个转录组数据，而Xenium则采用了更加靶向的方法。此外，我们还注意到，在某些组织类型（但不是全部）中，以高于我们推荐的深度进行测序会导致单基因灵敏度显著升高。因此，在某些组织或样本中，转录本丰度和单基因灵敏度会随着测序深度而有所调整。
灵敏度比较

选择分辨率：

如何分配转录本以及如何精细地分配？

分辨率：包括将转录本分配到定义的组织区域或细胞中的哪个位置，以及观察它们的最精细程度。
Visium HD中的转录本被分配到一个小到足以捕获单细胞的区域。具体来说，利用CytAssist仪器将结合的探针精确转移至捕获区域，其中寡核苷酸连续排列在数百万个2 x 2 µm条形码标记的正方形中。然后以2 x 2 µm正方形单位以及多个合并单位输出这种基于空间条形码的测序读数（包括8 x 8 µm合并单位，这是我们推荐的分析起点）（图1A）。
由于这些正方形单位小到足以捕获单细胞，这种方法能表征每个单位中存在的主要细胞类型。考虑到这种合并策略和真核细胞的平均大小（介于10到100 µm），每个合并区域可能覆盖不止一个细胞的组分；因此，Visium HD带来了我们所说的单细胞分辨率（图1B）。第三方工具可帮助您对Visium HD数据进行数据点解卷积。
图1A. Visium HD的捕获区域结构。这张示意图展示了Visium HD玻片的布局，带有两个6.5 x 6.5 mm的Visium HD捕获区域，其中捕获寡核苷酸连续排列在细分为2 x 2 µm的正方形单位内。
图1B. 对H&E染色后的人类结肠癌组织的Visium HD分析，转录本被分配到8 x 8 µm的合并单位内。图中展示了带有无监督基因表达聚类的人类结肠癌缩小图像（左图），以及8 x 8 µm单位内的基因表达聚类放大图像（右上图）和H&E染色组织放大图像（右下图）。Visium HD能够分辨2 x 2 µm正方形内的转录本，但我们建议以8 x 8 µm的合并单位作为起点进行可视化和分析。
Xenium原位分析将转录本分配到单个细胞中（图2）。在Xenium运行过程中，组织中的每条转录本会被分配X-Y-Z轴坐标。之后，在仪器运行过程中进行多模态细胞分割，利用各种形态学染料和专门的人工智能算法来确定各个细胞的边界。根据这些边界及其空间坐标将每条转录本分配给单个细胞，精度达到纳米级（XY轴定位精度 < 30 nm，Z轴定位精度 < 100 nm）。
图2. 利用Xenium Explorer对人类肺腺癌进行分析。上图显示的是人类肺腺癌切片的图像，下图显示了Xenium Explorer放大后的图像，图中展示了分割的细胞以及定位在单个细胞内的与免疫细胞类型相关的选定转录本。
分辨率比较

超越基因表达：

利用多组学功能获取更多信息

多组学分析：除了RNA之外，您可以测定的全套分析物，比如形态、蛋白质等。
Visium HD和Xenium都能评估同一张切片的形态（H&E染色）、蛋白质（免疫荧光IF染色）和RNA数据。在撰写本文时，Visium HD可在单张切片上进行H&E或IF染色，而Xenium可进行两种染色。
对于Visium HD分析，H&E或IF染色是在工作流程开始前进行的，这让您能够在Visium流程之前利用成像数据筛选组织切片。
对于Xenium，H&E和IF染色在Xenium工作流程结束后进行。客户还可以利用Xenium化学方法的非破坏性特点，在Xenium流程结束后对同一张切片进行Visium分析（我们正在定量Xenium分析对Visium HD的分析性能有何影响，如果有的话）。最后，我们预计在2024年晚些时候推出适用于Xenium平台的< 30重集成蛋白质组学解决方案。

从理论思考到实际问题：

组织类型、样本形式和经费考量等

在试图将新技术整合到您的实验室中时，实用性是关键的因素。在这一部分，我们将分析一些重要的考虑因素，如组织类型、样本形式、数据分析方法和仪器使用。
组织固定、兼容物种和组织形式
组织是整个实验的基础，而两个因素将决定分析的进程——组织是否固定以及它来源于哪个物种。
Xenium和Visium HD分析都与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织兼容，而Xenium还与新鲜冷冻组织兼容。我们计划在近期发布一套利用Visium HD分析新鲜冷冻组织的示范方案。
在物种兼容性方面，Visium HD可以对人类和小鼠进行全转录组分析。如果您有意向分析非人类灵长动物或大鼠组织，请发邮件至support@10xgenomics.com，我们也许能提供您的物种与人类和小鼠探针组的同源性报告。对于Xenium分析，我们提供了人类和小鼠的预设计且可定制的基因组合。此外，Xenium分析也兼容其他物种，您可以通过高级定制设计流程（6）来创建基因组合，分析带有转录组注释的任何物种。
组织形式也是一个重要的考虑因素。Visium CytAssist仪器允许您使用存档或预先切片的载玻片，以及从FFPE组织块中专门新鲜制备的载玻片。Xenium则要求在Xenium载玻片上直接进行组织切片。
如果您的组织是FFPE组织，来源于人类或小鼠，那么与任一平台兼容。Xenium分析也与新鲜冷冻组织兼容，在即将发布的示范方案中，这一功能将扩展到Visium HD。如果您研究的物种既非人类又非小鼠，Xenium可通过高级定制设计选项与任何物种兼容，而Visium HD可能与非人类灵长动物或大鼠兼容（取决于客户支持指南）。

样本数量、组织大小和时间限制

对于任何技术而言，样本越多，耗时越长。然而，这一普遍规律有两个主要差别。首先，额外花费的时间并不一定因每个额外样本呈线性增加。其次，组织样本在捕获区（Visium HD）或成像区（Xenium）的排列方式多种多样——一张载玻片可以容纳一个大样本、几个中等样本或多个小样本（图3）。考虑到这一差别，从运行的玻片数量（而非严格意义上的分析样本数）来考虑这些技术可能会有所帮助。
图3. Visium HD和Xenium载玻片上的组织放置方式示例。Visium HD（上图）或Xenium（下图）的单次运行可根据各种不同的组织配置来优化，包括（但不限于）单块大切片和组织芯片，具体取决于实验的需求。
作为一种基于NGS的技术，每次Visium HD运行的输出结果是一个测序文库。这样您就能在单次NGS运行中批量处理大量样本。因此，在Visium分析时，您能够通过批量处理大量样本的测序文库来扩大规模。Visium HD工作流程本身大约需要2-3天，其中手动操作约8小时，并且可根据样本、人员、热循环仪和CytAssist仪器的可用性进行并行处理。
Xenium是一种基于成像的技术，而单细胞空间成像实验中最耗时的部分就是成像。尽管我们已经竭尽全力来优化这些步骤，但每次Xenium运行都需要自己的图像采集和分析，这与基于NGS的Visium HD工作流程中的测序步骤最为相似。
对基于成像的Xenium来说，组织分析时间和通量随分析的组织总面积和分析多重性而定。在利用480重基因组合分析总面积为4 cm2 的组织（使用多模态细胞分割）时，我们预计手动操作时间为6小时，图像采集前的准备时间为2-3天，这些操作可并行开展，取决于样本、人员和扩增仪器的可用性。基于这些参数，图像采集和分析可能需要长达3天的时间，不过您可以选择分析组织上的部分区域来缩短运行时间。

数据分析方法

Xenium原位分析和Visium HD分析的数据最终分别以基于成像和测序的形式输出。两个平台都提供了直观的数据可视化和分析流程，并与第三方工具轻松兼容，让您能够充分利用数据。
在Visium文库测序完成后，通过Space Ranger分析流程运行数据。这些输出结果（包括但不限于特征条形码矩阵（h5）和组织位置（parquet）等文件格式）可通过Loupe Browser进行可视化，并对Visium聚类进行差异分析和再聚类（图4）。
图4. Loupe Browser中的Visium HD数据可视化示例。可视化结果呈现了E17小鼠胚胎中转录本的表达分布。
Xenium数据的机载分析与图像采集和分析步骤同步进行，因此在运行结束后会立即生成可解释的数据，具体格式包括ome.tiff（图像）、.parquet、.zarr和.csv（转录本）。这些输出结果可通过Xenium Explorer进行可视化（图5）。
图5. Xenium Explorer中的Xenium数据可视化范例。可视化结果呈现了利用Xenium人类多种组织和癌症基因组合分析的FFPE人类肺癌组织。
Xenium和Visium HD都特有全面整合且直观的数据可视化和分析流程、多种开放格式的文件输出以及与第三方分析工具的轻松兼容。
 
如果您想了解visium HD 和Xenium，欢迎您联系我们！

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